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MALDI的原理是用激光照射樣品與基質形成的共結晶薄膜，基質從激光中吸收能量傳遞給生物分子，而電離過程中將質子轉移到生物分子或從生物分子得到質子，而使生物分子電離的過程。因此它是一種軟電離技術，適用于混合物及生物大分子的測定。TOF的原理是離子在電場作用下加速飛過飛行管道，根據到達檢測器的飛行時間不同而被檢測即測定離子的質荷比（M/Z）與離子的飛行時間成正比 ，檢測離子。
質譜（MS）通過分析分子離子的質量電荷比（m/z）來鑒定和定量檢測分子。質譜儀內的質譜可以解釋為測定一個樣本內不同分子的特性。質譜儀可以直接分析任何易電離的生物分子。
基質輔助激光解吸/電離（MALDI）的優勢在于其樣本與化學基質混合產生離子，使得樣本分析前處理工作大大減少。基質輔助激光解吸/電離飛行時間質譜（MALDI-TOF MS）結合了兩個技術，包括基質輔助激光解吸/電離（MALDI）離子源和飛行時間質譜（TOF）。基于基質輔助激光解吸/電離飛行時間質譜（MALDI-TOF MS）的概念，質譜完全改變了臨床微生物室中的微生物的鑒定方法，因為它是一個快速、高通量、低成本的以及高效的系統。
原理：將樣品分散在基質分子中并形成晶體。當用激光照射晶體時，基質從激光中吸收能量，樣品解吸附，基質-樣品之間發生電荷轉移使得樣品分子電離，電離的樣品在電場作用下飛過真空的飛行管，根據到達檢測器的飛行時間不同而被檢測，即通過離子的質量電荷之比（M/Z）與離子的飛行時間成正比來分析離子，并測得樣品分子的分子量。例如，檢測DNA樣品時，DNA離子按其質量大小先后通過檢測器，DNA片段越短，越早到達檢測器。
樣品種類一般為：蛋白質、核酸、多肽、大分子等。依據測試結果分為：低分辨和高分辨，低分辨精確到小數點后1位，高分辨精確到小數點后4位。
測試模式：有線性模式和反射模式，線性模式適合大分子（如蛋白質，核算，多聚物等），此模式分辨率和質量準確度低于反射模式，通常測得的為平均分子量。反射模式適合分子量＜5000Da的物質，如多肽，寡糖等，該模式分辨率高，可準確測得單同位素分子量。模式下面又分為：正離子和負離子模式，分子結構不同，有的更容易帶正電，有的更容易帶負電，正離子看的是帶正電的離子，負離子看的是帶負電的離子。常規是正離子模式。
